qPCR 相对定量详细说明书

用于目标基因与内参基因 Ct 数据的 ΔCt、ΔΔCt 和 RQ 计算，并保留每个生物学重复用于统计和 Prism 作图。

1. 计算原理

每个样本先计算 ΔCt = Ct(目标基因) - Ct(内参基因)。再以对照组为校准计算 ΔΔCt = ΔCt(样本) - 平均ΔCt(对照)，相对表达量为 RQ = 2^-ΔΔCt。

2. 新建项目和输入数据

• 项目默认名为 相对定量_YYYYMMDD，可在创建时修改。
• 可直接粘贴“组名、目标 Ct、内参 Ct”三列数据，也可在手动表格中逐组填写。
• 粘贴 Excel 数据时可使用 Tab、逗号或连续空格分隔；第一行表头会自动识别。
• 解析后先核对分组、重复数量和缺失值，再开始计算。

3. 对照组和重复结构

1. 在每个组中填入一一对应的目标基因 Ct 与内参 Ct。
2. 选择一个生物学对照组。对照组不是“第一条数据”，而是实验设计中的校准条件。
3. 同一样本的技术重复应先确认一致性；生物学重复必须作为独立重复保留。
4. 不要把同一个生物样本的多个技术孔错误地当成多个生物学重复。

4. 计算和质量检查

• 检查 Ct 是否落在实验可接受范围，过高 Ct、未检出孔和明显异常孔应按预先规则处理。
• 核对目标与内参是否来自同一生物样本。
• 计算后查看每个重复的 ΔCt、ΔΔCt 和 RQ，不要只看组均值。
• 若对照组 RQ 不是围绕 1 分布，先检查对照选择和数据配对。

5. 图表和比较

• 柱状散点图保留每个生物学重复，柱/横线表示汇总值。
• 可修改 Y 轴名称、上限和比较线，导出 SVG 继续排版。
• 比较组较多时，先完成主要比较，避免图面标注拥挤。

6. Prism 文件导出

• 点击 Prism 导出生成 .pzfx，每组作为 Column 数据列，每行保留一个生物学重复。
• CSV 用于跨软件核对；SVG 用于文章图形排版；项目 JSON 用于恢复整个分析。
• 若点击导出无反应，确认已经完成计算，并从正式工作台而不是浏览器单独打开模块。

7. 保存和打开项目

• 点击“保存项目”后选择文件名和路径。
• 项目首页按日期管理，支持搜索、文件夹和回收站。
• 重新打开项目后仍应核对对照组、图表设置和最终结果。

8. 常见问题

解析后分组不正确

检查粘贴数据是否每行三列，组名中不要混入不可见换行；必要时改用手动表格。

出现空结果或无穷值

检查 Ct 是否为空、非数字，或 ΔCt/ΔΔCt 是否因错误配对而异常。

Prism 中重复顺序变化

以导出的 Column 数据表为准；需要固定样本顺序时，在输入阶段按同一生物样本顺序排列各组。